姚 森1,2，劉鴻高1，李 濤3，李杰慶1,*，王元忠2,4,*

（1.云南農業大學農學與生物技術學院，云南 昆明 650201；2.云南省農業科學院農產品加工研究所，云南 昆明 650221；3.玉溪師范學院資源環境學院，云南 玉溪 653100；4.云南省省級中藥原料質量監測技術服務中心，云南 昆明 650200）

摘 要：采集5 種共272 份牛肝菌樣品的傅里葉變換紅外光譜和紫外光譜，結合多光譜信息融合策略，建立牛肝菌種類快速鑒別的方法。多元散射校正（multiplicative signal correction，MSC）及二階導數（second derivative，2D）等預處理方法對原始光譜進行優化，比較優化處理對區分不同種類牛肝菌影響；利用優化處理后的光譜數據及融合數據建立偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）模型和支持向量機（support vector machine，SVM）判別模型。結果顯示：1）經過2D和MSC預處理后，不同種類牛肝菌的PLS-DA鑒別效果優于未優化模型，表明2D+MSC預處理優化了光譜信息并提高了分類準確度；2）基于傅里葉變換紅外光譜、紫外光譜、低級融合和中級融合數據分別建立PLS-DA模型，預測正確率為86.87%、66.67%、78.89%和95.56%；建立SVM判別模型，預測正確率分別為88.89%、74.44%、91.11%和100.00%，表明中級融合技術對不同種類牛肝菌鑒別效果顯著，優于其他技術；3）中級融合技術在PLS-DA模型和SVM判別模型中對樣品的預測正確率分別為95.56%和100.00%，表明SVM判別模型對牛肝菌種類區分效果優于PLS-DA模型。采用中級融合技術建立SVM判別模型，快速鑒別牛肝菌種類，為牛肝菌種類鑒別和質量控制提供可靠、穩定的方法。

關鍵詞：數據融合；牛肝菌；種類鑒別；紫外光譜；傅里葉變換紅外光譜

牛肝菌是牛肝菌目（Boletales）大型真菌，除了少數品種有毒、味苦不能食用外，大部分品種可以食用[1]。其菌肉肥厚，味道鮮美，口感細膩，富含蛋白質、纖維、多糖、維生素和鐵、鋅、鈣等礦質元素，同時具有抗氧化性、抗腫瘤、抗病毒、健胃等藥用功效，是天然的保健食品，兼具食藥用價值，深受國內外消費者青睞[2-3]。

云南是我國牛肝菌種類最豐富的地區之一，已知牛肝菌224 種，其中可食用牛肝菌144 種[4]。牛肝菌種類繁多，形態相似，采用傳統方法觀察鑒別難度大，因誤采誤食造成中毒事件時有發生[5]，目前對快速、有效鑒別牛肝菌種類的研究較少，同時市場上對食用牛肝菌分類模糊，以次充好的現象屢見不鮮。李艷春等[6]研究了市場上4“種”常見牛肝菌的DNA條形碼，結果表明4“種”牛肝菌樣品代表了12 個物種；Dentinger等[7]對超市購買的中國云南出口美味牛肝菌進行DNA測序分析，發現同一包裝袋內15 片牛肝菌中有3 種新牛肝菌物種。現今，市場上的欺詐行為嚴重威脅消費者健康，損害消費者利益，擾亂食用菌市場。準確鑒別野生牛肝菌是保障消費者安全，維護人民利益，進一步開發利用和加強市場質量監控的重要前提。

目前，食用菌鑒別分類研究主要集中在光譜法和分子生物學方法。Moha?ek-Gro?ev等[8]采集30 個不同屬野生菌的紅外光譜，對光譜信息進行解析，結果顯示不同野生菌樣品的紅外光譜差異明顯，其中1 200～1 000 cm-1的差異可以作為不同屬野生菌的特征區。楊天偉等[9]采用紫外光譜（ultraviolet spectroscopy，UV）技術結合主成分分析對不同產地、種類可食用牛肝菌進行研究，結果表明其紫外圖譜具有指紋特性，主成分分析顯示不同種類牛肝菌對營養成分積累有明顯差異，可以用于鑒別不同產地、種類食用牛肝菌。Mello等[10]根據ITS片段設計引物，采用分子生物學方法成功鑒別銅色牛肝菌（Boletus aereus Bull.）和美味牛肝菌（B. edulis Bull.）。單一的光譜法對樣品有效信息提取率低，容易受到各個因素（如溫度、濕度、CO2濃度、溶劑等）影響；分子生物學方法費用昂貴，操作復雜，不適合推廣應用。

數據融合是將多個來源信息加以過濾、優化、整合，得到更加準確、可靠的數據信息，其目的是通過各儀器間協同作用，獲得比單一技術更準確的分類結果[11-12]，已被廣泛應用于食品、飲料的鑒別和質量評價等領域[13-16]。數據融合分為低級融合、中級融合和高級融合，低級數據融合是將不同儀器獲得的數據進行簡單的串聯，形成更全面的數據集[17]；中級融合是將不同來源的數據經過特征提取，并對選取特征變量（如主成分）進行整合，去除干擾信息，從而獲得更加豐富、系統的數據集[18-19]；高級融合為決策級融合，結合兩個或兩個以上分類模型得出最佳鑒別結果[20]。目前，大多數學者采用低級或中級融合技術，僅10%的研究采用高級融合技術[21]。在本實驗中，中級融合分類正確率已經達到100%，因此不對高級融合進行深入的研究分析。

本研究采用傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）法和UV法，具有花費低、速度快、靈敏度高、可靠性強等優點[22-23]。采用二階導數（second derivative，2D）、多元散射校正（multiplicative scatter correction，MSC）、數據融合等方法優化樣品信息，通過偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）和支持向量機（support vector machine，SVM）比較FTIR、UV、低級融合和中級融合技術對不同種牛肝菌的分類效果，快速及有效鑒別野生食用菌，為加強市場監控提供理論基礎與科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用5 個不同種類牛肝菌（皺蓋疣柄牛肝菌、栗色牛肝菌、小美牛肝菌、美味牛肝菌和雙色牛肝菌）均采自云南省，共272 份樣品，樣品詳細信息見表1。

表1 牛肝菌樣品信息
Table 1 Information about boletes samples

KBr 天津市風船化學試劑科技有限公司；氯仿云南楊林工業開發區汕滇藥業有限公司。所有化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Frontier型FTIR儀（配備硫酸三甘肽晶體氘化檢測器，掃描范圍為4 000～400 cm-1，掃描信號累加16 次，分辨率為4 cm-1） 美國Perkin Elmer公司；UV-2550型紫外-可見分光光度計（掃描范圍190～600 nm，狹縫寬度1 nm） 日本島津公司；SY3200-T型超聲波清洗儀（功率150 W，頻率55 kHz） 上海聲源超聲波儀器設備有限公司；YP-2型壓片機 上海市山岳科學儀器有限公司；FW-100型高速粉碎機 天津市華鑫儀器廠；80目標準篩盤 浙江上虞市道墟五四儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 FTIR采集

樣品采集后清洗干凈，50 ℃烘干，粉碎后過80 目標準篩，備用。按1∶100的比例，準確稱量（1.5±0.2）mg牛肝菌樣品和（150±20）mg溴化鉀粉末，放入瑪瑙研缽充分混合研磨成細粉，將細粉倒入壓制磨具中壓制成片。將FTIR儀預熱30 min后進行FTIR掃描，樣品重復測定2 次，取平均光譜；掃描前使用空白樣本扣除CO2和H2O的干擾。

1.3.2 UV采集

稱取（0.1±0.002）g牛肝菌樣品粉末置于石英比色皿中，加入10 mL氯仿溶劑，超聲提取30 min，三層濾紙過濾，取清液備用。紫外-可見分光光度計預熱30 min后測定樣品UV，重復掃描2 次，取平均光譜，掃描間隔1 nm。

1.4 數據分析

FTIR儀和紫外-可見分光光度計在采集光譜信息時，會夾雜背景噪音、散光等干擾信息。為消除干擾信息，紅外原始光譜通過OMNIC 8.0軟件進行平均光譜、自動基線校正、平滑、縱坐標歸一化等預處理，紫外原始光譜采用UV probe 2.34軟件進行平滑等預處理；同時，采用2D+MSC對FTIR和UV分別進行優化處理。

原始光譜經預處理后，選取具有指紋特性的原始光譜數據進行串聯，形成一個包含大量變量的獨立數據矩陣，完成低級融合。采用SIMCA-P+13.0軟件對FTIR和UV數據分別進行PLS-DA，提取主成分并整合，進行中級融合。

SIMCA-P+13.0軟件對光譜數據進行2D、MSC優化處理，Origin 8.0軟件作圖，通過SIMCA-P+13.0軟件和MATLAB R2014a軟件分別進行PLS-DA和SVM分析，建立判別模型，比較分類結果。

2 結果與分析

2.1 原始FTIR檢測結果

釆用OMNIC 8.0軟件對272 份牛肝菌FTIR進行平滑、基線校正和縱坐標歸一化等預處理。選取牛肝菌FTIR特征吸收峰的集中波段在2 000～400 cm-1內，用于區分牛肝菌種類。如圖1所示，不同種類牛肝菌的FTIR較為相似，共有峰波數大致相同，在1 634、1 480、1 400、1 319、1 253、1 078、1 057 cm-1等波數附近有明顯吸收峰，但不同種牛肝菌樣品吸收峰的強度有差異。1 634 cm-1附近吸收峰為C＝O伸縮振動，為蛋白質酰胺I帶；1 480 cm-1附近歸屬為亞甲基的彎曲振動；1 400、1 319、1 253 cm-1等附近為多糖、蛋白質等的C—O—H彎曲振動和亞甲基的變形振動；1 078、1 057 cm-1附近分別為糖類的C—O和C—C伸縮振動；950～710 cm-1波段有多個弱吸收峰，主要為糖類異構體的特征峰[24-25]。

圖1 5 種牛肝菌的FTIR
Fig. 1 IR spectra of fi ve boletus species

2.2 原始紫外圖譜分析

在采集樣品UV過程中，容易受到溶劑、儀器、環境等干擾，采用UV probe 2.34軟件對牛肝菌樣品進行平滑等預處理。由于在190～230 nm波長內UV受干擾嚴重，且400 nm以后無明顯特征吸收峰，牛肝菌UV的特征吸收峰集中在230～400 nm波長范圍內，因此選取230～400 nm波長范圍的171 個變量作為樣品信息用于區分牛肝菌種類。如圖2所示，在240～400 nm范圍內5 種牛肝菌樣品光譜圖峰形相似度高，在250～350 nm區間有明顯的特征吸收峰，274、285、296 nm附近為樣品共有峰，表明不同種牛肝菌的化學組分相似；5 種牛肝菌樣品的峰強、峰位和峰面積存在差異，尤其在230～240 nm區間差異明顯，具有指紋特性，能夠作為區分不同種類牛肝菌的依據。

圖2 5 種牛肝菌的UV
Fig. 2 UV spectra of fi ve boletus species

2.3 主成分提取

采用PLS-DA提取主成分，R2Y表示主成分累計貢獻率，貢獻率越高代表樣品信息越多；Q2表示主成分對樣品的預測能力，Q2越大表示預測能力越強[26]。如圖3所示，當Q2達到最大值時，FTIR前16 個主成分累計貢獻率達90.35%，UV前30 個主成分累計貢獻率達74.86%，能夠代表樣品的主要信息。將兩種光譜數據的主成分組合在一起，進行中級融合，形成新的數據集為進一步鑒別分析做準備。

圖3 PLS-DA提取主成分得分圖
Fig. 3 Scores plots for principal components extracted by PLS-DA

2.4 PLS-DA結果

PLS-DA是基于偏最小二乘回歸的一種有監督的判別分類方法，利用自變量矩陣X和分類變量Y建立回歸模型，通過PLS預測未知樣品類別的方法[27-28]。采用PLS-DA比較預處理對分類效果的影響。圖4顯示，經過預處理后FTIR較UV對不同種牛肝菌的區分效果更好；經過預處理后的區分效果優于原始的效果，表明2D和MSC預處理對FTIR和UV的優化效果較好。

圖4 不同種牛肝菌PLS-DA得分圖
Fig. 4 Scores plot for PLS-DA of different species of bolete mushrooms

隨機選取90 個樣品（約樣品量的1/3）作為預測集，其余182 個樣品作為訓練集。對FTIR、UV、低級融合和中級融合數據分別建立PLS-DA判別模型。如表2所示，FTIR技術與UV技術相比，FTIR判別模型具有更高的準確度，表明FTIR結合PLS-DA建立判別模型對未知樣品的分類更加準確。低級數據融合技術對不同種牛肝菌的分類正確率高于UV技術，低于FTIR技術，表明低級融合豐富了光譜數據，同時簡單的數據串聯將無效信息相互疊加，降低分類正確率。結果與Roussel等[29]的結論一致，受干擾信息影響，不是所有情況下數據融合得到的結果都優于單獨儀器。同時，中級數據融合訓練集和預測集的正確率分別達到98.90%和95.56%，正確率高于單一光譜技術，分類效果優于低級融合，表明中級融合技術在融合過程中去除了大量干擾信息，能夠建立更穩定、可靠的判別模型。

表2 PLS-DA對不同數據集的分類結果
Table 2 Results of PLS-DA of different data matrixes

2.5 SVM

SVM是基于統計學習理論的模式識別方法，主要應用于模式識別領域，能夠解決小樣本、非線性和高維數等問題，有效防止過擬合現象[30-31]，該方法已被廣泛應用于原材料鑒別、食品分析等方面[32-34]。SVM模型選取訓練集和預測集的方法同2.4節，采用網格搜索法篩選建模的最佳參數，基于FTIR、UV、低級融合和中級融合數據分別建立SVM判別模型。如圖5所示，UV技術分類錯誤最多，中級融合全部分類正確，表明中級融合對牛肝菌種類的鑒別效果最佳。

圖5 SVM對測試集的實際分類和預測分類圖
Fig. 5 Plots of actual and predicted categories of test samples by SVM

表3 SVM對不同數據集的分類結果
Table 3 Results of SVM of different data matrixes

如表3所示，4 個數據集建模穩定性依次為中級融合＞低級融合＞FTIR＞UV。同時低級融合對樣品的預測正確率高于單個技術，表明低級融合數據比單個儀器數據更全面，判別效果更好；中級融合的分類正確率高于低級融合，證明中級融合在整合數據過程中去除了無效信息，避免兩種光譜信息的互相干擾，提高分類正確率。該結論與Biancolillo等[19]研究結果相吻合，多種光譜技術對食品進行鑒別分析，低級和中級數據融合區分效果皆高于單一光譜技術，并且中級數據融合優于低級數據融合。比較表2和表3可知，采用中級融合技術建立SVM判別模型，模型穩定、可靠，對不同種牛肝菌鑒別效果最佳。

3 結 論

采用FTIR法和UV法采集云南地區常見牛肝菌物種的光譜信息，選擇MSC和2D分別對牛肝菌FTIR和UV進行優化處理。優化后的光譜數據進行PLS-DA，結果顯示同種類牛肝菌樣品能較好地聚集在一起，部分不同種類牛肝菌樣品混在一起，難以區分；表明優化處理對牛肝菌種類區分效果優于原始光譜，且FTIR對不同種牛肝菌的區分效果優于UV。

采用低級和中級數據融合策略對兩種光譜數據進行融合，通過PLS-DA和SVM建立分類鑒別模型，并比較FTIR、UV、低級融合和中級融合技術對不同種牛肝菌鑒別效果。結果顯示：中級數據融合建立的SVM判別模型預測正確率分別為95.56%和100.00%，高于其他模型，表明中級融合對不同種牛肝菌區分效果最佳，且SVM建立分類模型更穩定、可靠。中級融合技術結合SVM建立鑒別模型，能夠準確、有效區分不同種牛肝菌，為快速鑒別野生食用菌提供有效方法，對維護食用菌市場的穩定具有重要意義。